近年来，随着干细胞再生医学技术的迅猛发展，由干细胞分泌的微小囊泡——外泌体，也逐渐成为医学界关注的热点，被应用于多种疾病临床试验研究之中。

尽管越来越多的科研实验证实外泌体用于临床应用的有效性，但如何稳定保存外泌体、怎样可以不丧失其功能性显得尤为重要，甚至成为了评判一款外泌体产品优劣的关键性因素。

外泌体的保存/ EXOSOMES

外泌体是具有双层脂膜的囊泡结构，其稳定性较好，可保护内部生物分子免受体液中各种酶的影响，从而保持其完整性和生物活性。但提取后的外泌体的完整性和生物活性也可能受到保存介质、保存温度和时间等因素的影响。

目前，最常用的储存方法为冷冻保存，但是冷冻保存可能会导致外泌体形状与物理性质的改变，也可能导致多层囊泡的形成和聚集，反复冻融会导致外泌体表面分子的生物特性、含量和标志物组成发生变化。 

血清中包含外泌体在内的细胞外囊泡DNA在不同储存环境可保持稳定, 血浆存放于4°C时其RNA会显著降解, 在–20°C下长期保存也会导致血浆中外泌体总RNA降解, 但miRNA却十分稳定 这也提示了外泌体miRNA作为生物标志物的潜力。

不过也有研究表明, 血清中的miR-122和miR-145非常不稳定, 将血清在4°C短期保存期间即发生降解, 这可能是由外泌体的异质性所导致的。–80°C保存被公认是保存各种生物标本如精液、尿、牛奶、 血液和支气管肺泡灌洗液最适宜的保存环境，虽然这样保存血浆可能产生含有大量“污染物”的外泌体。4°C保存虽然容易导致外泌体中蛋白和核酸的损失, 但却能够避免冻融过程造成的囊泡破坏。 

实验室中常规的外泌体存储条件一般是4℃、-20℃、-80℃。在一项研究中，研究者评估了储存在4℃，-20℃和-80℃下长达28天的外泌体的稳定性，并将其与新鲜的外泌体进行了比较。

外泌体在储存于−80 °C，−20 °C，以及4 °C 下，0、7、15以及30天后，再通过WB检测三种外泌体标记物TSG101，HSP70和ALIX的水平。结果显示，在4℃下放一个月，外泌体的标记蛋白几乎完全降解，活性全无。

研究者发现，与新鲜分离的外泌体相比，不同的存储温度和存储时间会影响外泌体的稳定性、大小分布和颗粒数量（Fig.1），并影响了外泌体的细胞吸收和生物分布（Fig.2）。对于功能性研究，根据研究设计建议对新鲜分离的外泌体进行立刻分析或在4 ℃或-20℃下短期保存后使用。但是对于长期保存用于治疗应用的外泌体，-80℃存储条件将是更可取的。 

不同存储条件对外泌体大小和结构的影响

不同存储条件对外泌体蛋白成分的影响

实验结果：在-20℃和-70℃下保存的外泌体比较完整无损，而4℃和室温下CD63已基本没有表达，室温保存条件下HSP70的表达量也有所降低。相较于4℃、-70℃和新鲜样本，室温存放的外泌体蛋白和RNA浓度的降低程度较明显。研究说明，-20℃或更低温度是比较可取的外泌体长期存储条件。 

外泌体虽然建议保存于−80 °C环境下, 但在处理或运输过程中有时很难维持这种低温条件。

研究发现一种冻干法可以保存外泌体，在冷冻过程中使用海藻糖作为保护剂，海藻糖可以提供生物保护作用，如稳定蛋白质、细胞膜和脂质体；减少冷冻过程中冰的形成；防止蛋白质以及外泌体的聚集；减少分离和保存过程中细胞外囊泡的损失等。这是目前外泌体应用在护肤品中最常用的形式。

参考文献：Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes   Protein Cell 2019, 10(4):295–299  https://doi.org/10.1007/s13238-018-0529-4